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凝膠滲透色譜柱概述

更新時間:2024-11-21      點擊次數(shù):2647

  凝膠滲透色譜柱(Gel Filtration Chromatography)是一種基于分子尺寸的分離方法,屬于分子排阻色譜(Size-Exclusion Chromatography)的一種。它利用介孔凝膠柱將樣品溶液進行分離,分離物根據(jù)其分子量或分子體積大小在柱中不同孔隙大小的分子篩上發(fā)生滲透和分配,從而實現(xiàn)樣品分離純化的方法。

  凝膠滲透色譜柱是一種分子大小分離技術,也被稱為凝膠過濾色譜柱。它利用了多孔凝膠的不同孔徑來分離混合物中的不同分子。這種分離方法適用于分析水溶性高分子和生物大分子(如蛋白質(zhì)、RNA、DNA等)。

  基本原理:

  凝膠滲透色譜柱的基本原理是根據(jù)分子大小,大分子在凝膠孔隙中才能滲透,而小分子只能浸入孔隙,隨著溶劑在柱中流動的攪動,大分子在凝膠中滲透并被滯留,小分子穿過凝膠格子,在柱中流動迅速,在濃縮等某些條件下可以發(fā)生分離,達到分離物的純化的目的。

  凝膠滲透色譜柱可分為手工制備和工業(yè)生產(chǎn)。手工制備一般采用葡聚糖、瓊脂糖等多孔性凝膠作為填充物,填充后進行硬化和平均顆粒度篩選就可使用;而工業(yè)生產(chǎn)則采用合成樹脂作為填充物,其優(yōu)點是成本低、細孔率高、流速快等。

  應用范圍:

  凝膠滲透色譜柱廣泛應用于生化、分子生物學等領域,主要用于分離樣品中的蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等分子,以及糖蛋白、高分子等。凝膠滲透色譜柱通過分離不同尺寸的分子,純化目標分子,除去雜質(zhì),保障目標分子的活性并便于進一步研究。

  在生物技術和制藥工業(yè)中,凝膠滲透色譜柱經(jīng)常被用于研究蛋白質(zhì)、多肽和其他生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能,以及純化這些分子。同時,該技術還可用于檢測和分離聚合物和高分子材料中的雜質(zhì)。

 

  產(chǎn)品優(yōu)點:

  凝膠滲透色譜柱的優(yōu)點是在保持溶解性的前提下進行分離和純化,不會破壞生物分子中的三維結(jié)構(gòu),在操作方面也相對較為簡單且比較容易操作,是一種基礎的分離方法,容易與其他技術聯(lián)用,例如色譜層析法、電泳法等。

  但凝膠滲透色譜柱也存在一些缺點。操作時樣品受流速等環(huán)境因素的影響,凝膠柱可能會受到損壞或污染,導致純度低或失去生物活性等問題。另外在某些情況下,柱中充滿的凝膠還容易發(fā)生滯留,造成不良影響。

  注意事項:

  1、凝膠滲透色譜柱是GPC的關鍵部件,使用不當或撞擊跌落可能會降低柱效或造成損壞。因為測定的聚合物分子量分布范圍的多變性,為匹配其分子量范圍,GPC使用的柱子需要較為頻繁的更換。這樣可能導致色譜柱接頭部位的螺紋,因多次拆卸而磨損變形。在連接或拆卸時不要用力過猛,每次上緊的程度應盡量保持一致,略加用力使其不滲漏溶劑,這樣可以延長柱接頭的使用壽命。

  2、拆卸或者安裝色譜柱時,需要防止空氣進入。連接色譜柱時,泵保持低流速(例如0.2ml/min), 待接頭處有溶劑流出時,再與色譜柱相連接;色譜柱串聯(lián)時,待已連接上的第一根柱子出口有溶劑流出時,再接上第二根柱,依次類推,直到所有的柱全部連接完為止。

  3、柱子卸下時,也應在慢流速下先卸下出口處連接管,用塞子密封后,再卸下進口接管,滴加數(shù)滴溶劑后,用柱塞子密封保存。另外,為了防止氣泡進入泵系統(tǒng)、檢測器及色譜柱中,還應對所使用的流動相溶劑進行充分的脫氣。

  隨著使用時間和次數(shù)的增多,凝膠滲透色譜柱的柱壓逐漸升高,嚴重時甚至發(fā)生柱子堵塞。造成這種情況大部分是因為樣品或流動相溶液帶有少量的固體雜質(zhì),雜質(zhì)在色譜柱頭中的過濾片上堆積,導致液流不暢。

  另外,對于分子量較大的聚合物樣品,可能含有少量微凝膠,也會在過濾片堆積;一旦進入凝膠柱床內(nèi),將會堵塞流路,使柱壓增高,長此以往會損壞色譜柱。

  因此必須對使用的任何一級溶劑和樣品溶液過濾,濾去機械雜質(zhì)。在不具備條件的實驗室,應選用比柱頭過濾片孔徑更小一些的濾紙或5號或6號砂心漏斗中進行過濾后方可進樣或進溶劑操作;在有條件的實驗室,建議選用溶液過濾裝置,采用真空抽濾將溶劑或樣品溶液中的雜質(zhì)過濾掉。

  4、為了更好地保護柱子,可安裝保護柱或預柱過濾器裝置。特別是預柱過濾器裝置,使用簡單方便,造價低廉,可重復使用。它既可以保護色譜柱免遭污染堵塞,又可避免使用保護柱所造成的死體積增大。

  5、當過濾器連續(xù)使用造成堵塞導致泵壓升高時,可把濾片拆下來進行清洗,去除濾片表面沉積的污染物。如遇到難去除的污染物,可用6mol/L的硝酸清洗液超聲波清洗1h。經(jīng)多次清洗重復使用的過濾片,如發(fā)現(xiàn)難以恢復原來的性狀,可棄去換新過濾片裝上。

  6、不同的凝膠滲透色譜柱,有不同的耐壓極限,不可超壓使用。如果壓力過高,凝膠顆粒會受壓變形甚至被破壞,從而破壞了凝膠床的均勻性,產(chǎn)生裂縫或溝槽,降低柱效。

  7、對于多根串聯(lián)凝膠滲透色譜柱的接法,從保護色譜柱的觀點來看,透過極限較小的有機凝膠色譜柱,由于所含凝膠交聯(lián)度低,膠粒較軟,不能承受太高的壓力,建議以按凝膠孔徑由大到小的次序進行串聯(lián)為好。

  凝膠滲透色譜柱是一種常用的生物分子純化方法。通過調(diào)整柱徑和填充物孔徑大小,可以實現(xiàn)針對不同分子的選擇分離純化。凝膠滲透色譜柱也為其他高效、高精準的分離技術奠定了基礎,為研究生物分子領域的開展提供了保證。

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